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腫瘤壞死因子（TNF）

1975年，Carswell等發(fā)現(xiàn)并命名了TNF:先用細(xì)菌內(nèi)毒素處理小鼠，而后在小鼠的血清中發(fā)現(xiàn)一種物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致腫瘤壞死，并將其稱為腫瘤壞死因子。1984年，Pennica等首先對(duì)人TNF-a的cDNA進(jìn)行了成功克隆，并在大腸桿菌中得到了表達(dá)。1985年，Shalaby把腫瘤壞死因子分為TNF-α和TNF-β。腫瘤壞死因子( Tumor Necrosis Factor,TNF)是一種的具有抗腫瘤活性的細(xì)胞因子，具有抗腫瘤、抗病毒和免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性。

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

原核表達(dá)系統(tǒng)是基因表達(dá)技術(shù)中發(fā)展最早，應(yīng)用最廣泛的蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一。近幾十年，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)也不斷得到發(fā)展和完善，被科研及工業(yè)用戶大量用于各種重組蛋白表達(dá)。市面上的重組蛋白有30%是由大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)而來，是小分子細(xì)胞質(zhì)蛋白或結(jié)構(gòu)域表達(dá)的首選宿主。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的外源基因包括原核基因和真核基因；原核基因可以直接在大腸桿菌中表達(dá)出來，真核基因含有內(nèi)含子，大腸桿菌不能對(duì)mRNA進(jìn)行剪切形成成熟的mRNA，因此，真核基因一般以cDNA構(gòu)建表達(dá)載體在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)。

應(yīng)用方案

通過高壓細(xì)胞破碎儀使物料在柱塞作用下進(jìn)入可調(diào)節(jié)壓力大小的閥組中經(jīng)過特定寬度的限流縫隙均質(zhì)區(qū)在均質(zhì)閥內(nèi)產(chǎn)生三種效應(yīng):空穴效應(yīng)、撞擊效應(yīng)、剪切效應(yīng)的機(jī)械作用力從而打破細(xì)胞壁的束縛，把蛋白質(zhì)從組織或細(xì)胞中釋放出來盡可能保持原來的天然狀態(tài)，不喪失活性，達(dá)到高效率破碎細(xì)胞的效果。即使用高壓勻漿破碎法采用高壓細(xì)胞破碎法，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的壓力效應(yīng)，從而能夠有效地提取出蛋白質(zhì)，且處理量大、破碎速度較快。這是一種機(jī)械處理細(xì)胞，物理抽提方法。

解決方案

首先富集菌體，收集胞內(nèi)產(chǎn)物的細(xì)胞或菌體。然后進(jìn)行細(xì)胞重懸，用適當(dāng)?shù)木彌_液或培養(yǎng)液將離心或沉降等方法得到的固體（沉淀、細(xì)胞、活性物質(zhì)等等）重新懸浮。其次進(jìn)行細(xì)胞破碎，使產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到液相中。最后收集含生化物質(zhì)的液相，進(jìn)行碎片分離，分離除去細(xì)胞、菌體、細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)的沉淀物和絮凝體等固體懸浮物，得到上清液或?yàn)V液。然后從澄清的濾液中提取胞內(nèi)產(chǎn)物，從細(xì)胞裂解物中獲取目標(biāo)產(chǎn)物。

1、發(fā)酵罐培養(yǎng)：根據(jù)rmh-TNF的表達(dá)，使用單因素法對(duì)由rmh-TNF在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)維持時(shí)間、pH值、溶解氧等進(jìn)行了研究，選擇出較好的發(fā)酵工藝參數(shù)。根據(jù)rmh-TNF代謝特點(diǎn)，通過對(duì)補(bǔ)料工藝的研究，確定了注射用重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子發(fā)酵罐發(fā)酵開始誘導(dǎo)后高溫滅菌的補(bǔ)料培養(yǎng)基以流加的方式對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行補(bǔ)加的新補(bǔ)料工藝。

2、發(fā)酵液離心：用高速離心的方法收集菌體，將放罐接口與管式分離機(jī)進(jìn)液口連接，開啟管式分離機(jī)冷凍水的供水閥門，開啟管式分離機(jī)(16000 rpm),控制發(fā)酵液流速1.0-1.5L/min離心，上清液經(jīng)專用管道排至自動(dòng)滅活罐滅活后排棄。離心完畢后取出菌體。

3、菌體洗滌：將菌體混懸于TES溶液中，緩緩攪拌洗滌，用高速冷凍離心機(jī)，在4℃下，8000 rpm,離心20分鐘。重復(fù)洗滌操作一次。濕菌體稱重，-20℃冰箱保存。

4、菌體破碎：將菌體混懸，調(diào)節(jié)高壓勻漿機(jī)泵馬達(dá)進(jìn)氣閥門和出料管進(jìn)氣閥門使流出管壓力在5000-20000 Psi范圍內(nèi)對(duì)菌體進(jìn)行勻漿破碎得到細(xì)胞破碎液。

PhD優(yōu)勢

工程大腸桿菌HMS174菌種的全面檢定，確認(rèn)該重組菌rmh-TNF工程菌構(gòu)建正確，目的蛋白占菌體總蛋白的百分含量大于30%，菌種保持穩(wěn)定，菌種穩(wěn)定性好，呈短棒狀，無芽孢、支原體等微生物污染，革蘭染色及生化檢定呈典型的大腸桿菌特征，該菌適用于工程菌菌種庫。

◆破壁能力：高壓設(shè)計(jì)，輕松上壓；均質(zhì)效率高，工藝穩(wěn)定；穩(wěn)定的破碎能力，更高的胞內(nèi)物提?。患儥C(jī)械破碎，無化學(xué)污染；可放大工業(yè)化生產(chǎn)工藝設(shè)備

◆控溫效果：獨(dú)特溫控設(shè)計(jì)，內(nèi)置和外置雙向控溫，確保均質(zhì)過程及出料溫度可控。

◆活性保障：循環(huán)的控溫系統(tǒng)，蛋白活性不失活，細(xì)胞破碎后，活性保值高達(dá)99%                                                                 

◆無菌保障：金屬結(jié)構(gòu)連接，沒有O型圈或墊片，無死角設(shè)計(jì)；在線排空結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)；所有機(jī)型均可實(shí)現(xiàn)在線清洗（CIP）、循環(huán)清洗、拆裝清洗、在位滅菌（SIP）