PhD細胞破壁機-畢赤酵母破壁
應用背景
畢赤酵母體系是真核體系中操作簡單、成本低廉的系統(tǒng)，在蛋白加工、折疊、翻譯后修飾等方面具有諸多優(yōu)勢，在畢赤酵母體系中蛋白轉錄后糖基化所增加的寡糖鏈長度（平均每個支鏈8-14 個甘露糖殘基）非常接近高等真核生物的結構，活性幾率大大高于原核體系。與其他表達系統(tǒng)的基因存在于游離質粒上不同，它的表達質粒是通過同源重組整合在基因組上的，轉化簡單（不需要病毒原液），表達菌株可以長時間保持（大于10年）而不失活。
應用難點
胞內表達的優(yōu)點是表達量高，糖基化程度很低或無糖基化，胞內表達的重組蛋白具有良好的活性和生物安全性，但是胞內表達需要對細胞進行破碎才可以收集產(chǎn)物，由于畢赤酵母細胞的細胞壁按結構劃分為可分為三層，最里層是由葡聚糖的細纖維組成，它構成了細胞壁的剛性骨架，使細胞具有一定的形狀；上面的是一層糖蛋白；最外層是甘露聚糖，由1，6-磷酸二酯鍵連接成網(wǎng)狀。在該層的內部，有甘露聚糖-酶的復合物。破碎酵母細胞壁的阻力主要決定于壁結構交聯(lián)的緊密程度和它的厚度。
應用方案
通過高壓細胞破碎儀使物料在柱塞作用下進入可調節(jié)壓力大小的閥組中經(jīng)過特定寬度的限流縫隙均質區(qū)在均質閥內產(chǎn)生三種效應:空穴效應、撞擊效應、剪切效應的機械作用力從而打破細胞壁的束縛，把蛋白質從組織或細胞中釋放出來盡可能保持原來的天然狀態(tài)，不喪失活性，達到高效率破碎細胞的效果。即使用高壓勻漿破碎法采用高壓細胞破碎法，在細胞內產(chǎn)生的壓力效應，從而能夠有效地提取出蛋白質，且處理量大、破碎速度較快。這是一種機械處理細胞，物理抽提方法。
解決方案
首先富集菌體，收集胞內產(chǎn)物的細胞或菌體。然后進行細胞重懸，用適當?shù)木彌_液或培養(yǎng)液將離心或沉降等方法得到的固體（沉淀、細胞、活性物質等等）重新懸浮。其次進行細胞破碎，使產(chǎn)物轉移到液相中。最后收集含生化物質的液相，進行碎片分離，分離除去細胞、菌體、細胞碎片、蛋白質的沉淀物和絮凝體等固體懸浮物，得到上清液或濾液。然后從澄清的濾液中提取胞內產(chǎn)物，從細胞裂解物中獲取目標產(chǎn)物。
應用效果
高壓均質使酵母細胞破壁，酵母中更多的自溶物就更容易的釋放到水環(huán)境中，進一步的抽提量也就增加。高壓均質處理后酵母細胞壁破損使胞內物不再受細胞壁的限制，酶和底物的反應空間更加充足，反應產(chǎn)物的抑制作用減小，既增大了酶的活性，又保持酶的活力，還加快反應速度。酵母菌一般需要1300bar的壓力破碎3-4遍，破碎率可以達到 90%以上，常見的典型應用：HPV疫苗、諾如病毒疫苗、乙肝疫苗、手足口病疫苗等。
技術工藝
破壁工藝：PhD高壓均質處理
溫控要求：10℃以內
破壁難點：菌濃較高，此菌液破壁條件未知
破壁結果：破壁得率客戶認可
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